小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核的測定方法

實(shí)驗(yàn)原理

    染色單體或染色體的無著絲點(diǎn)斷片，或因紡錘體受損而丟失的整個染色體，在細(xì)胞分裂后期，仍然在細(xì)胞質(zhì)中。末期之后，單獨(dú)形成一個或幾個規(guī)則的次核，被包含在子細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，因比主核小，故稱為微核。大小應(yīng)為主核的1/20～1/5。微核的折光率及細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)性質(zhì)和主核一樣。微核率是和用藥的劑量或輻射累積效應(yīng)呈正相關(guān)，所以可用簡易的、快速、靈敏的微核計(jì)數(shù)來代替繁雜的畸變?nèi)旧w計(jì)數(shù)。Matter 和Schmid建立的微核測試是一種比較理想的方法，目前國內(nèi)外已把微核測試用于輻射損傷、化學(xué)誘變劑、新藥試驗(yàn)、染色體遺傳疾病及癌癥前期診斷等各方面。

    嗜多染紅細(xì)胞是分裂后期的紅細(xì)胞由幼年發(fā)展為成熟紅細(xì)胞的一個階段，此時紅細(xì)胞的主核已排出，因胞質(zhì)內(nèi)含有核糖體，Giemsa染色呈灰藍(lán)色，成熟紅細(xì)胞的核糖體已消失，被染成淡橘紅色。骨髓中嗜多染紅細(xì)胞數(shù)量充足，由于無核，極易觀察到微核，因此，骨髓中嗜多染紅細(xì)胞成為微核試驗(yàn)的細(xì)胞群。

實(shí)驗(yàn)對象

成年健康小鼠，體重25g左右，雌雄均可。

elisa試劑盒實(shí)驗(yàn)試劑與器材

（1）器材：顯微鏡、低速離心機(jī)、電子天平、解剖器械（搪瓷解剖盤、探針、剪刀、鑷子）、注射器、試管、試管架、磨口試劑瓶、滴管、染色缸、洗耳球、量筒、清潔載玻片。

（2）試劑：0.9％生理鹽水、滅活的小牛血清、環(huán)磷酰胺、甲醇、PBS (pH6.8)、Giemsa染液、瑞氏染液。

實(shí)驗(yàn)方法與步驟

（1）環(huán)磷酰胺處理：取骨髓前24h先給小鼠腹腔注入環(huán)磷酰胺，注射劑量為100mg／kg動物體重。

（2）取骨髓：用損傷脊髓法處死小鼠，然后用剪刀剪開大腿上的皮膚和肌肉，取出大腿骨，用一小塊紗布來回搓干凈附在骨上的肌肉碎渣。剪掉股骨兩端膨大的關(guān)節(jié)頭，然后用注射器吸取5ml生理鹽水，插入股骨一端，將骨髓細(xì)胞沖洗至10ml的離心管中?？芍貜?fù)沖洗多次，直至骨髓腔呈白色為止。

（3）離心處理：將所獲得的細(xì)胞懸浮液以 1000rpm離心10min，吸去上清液，在沉淀物中加入2滴滅活的小牛血清，制成細(xì)胞懸液。

（4）涂片：滴一滴懸液于載玻片一端，按常規(guī)方法涂片，在空氣中晾干。

（5）固定：將晾干的載玻片放入甲醇固定液中10min，取出晾干。

（6）染色：將制片平放在玻璃板上，用1∶9∶10的 Giemsa∶PBS∶瑞氏染液，染色15min，流水沖洗后晾干即可鏡檢。

（7）觀察：嗜多染紅細(xì)胞為年幼紅細(xì)胞，呈灰藍(lán)色，略大于紅細(xì)胞（紅色），微核多呈圓形和橢圓形，呈藍(lán)紫色或紫紅色（圖13-3）。

（8）結(jié)果分析：在顯微鏡下，每只小鼠骨髓涂片標(biāo)本計(jì)數(shù)1000~2000個嗜多染紅細(xì)胞，包括其中出現(xiàn)微核的細(xì)胞數(shù)，將結(jié)果填入表內(nèi)，并計(jì)算微核細(xì)胞率，觀察記錄結(jié)果（表13-2）。

按100mg/kg體重劑量給小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺，其嗜多染紅細(xì)胞微核率為（48.9±3.6）％。正常小鼠嗜多染紅細(xì)胞微核率為5‰以下，超過5‰為異常。