研域百科:神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)

因?yàn)樯窠?jīng)干細(xì)胞(Neural Stem Cell)具有自我更新和多向分化的潛能，因而，可以選用懸浮神經(jīng)球培養(yǎng)的方法來獲得和研討。即將胚胎腦組織處理成單個(gè)細(xì)胞后，只有具有自我更新才能的細(xì)胞才能在培養(yǎng)液中克隆增殖成為懸浮的神經(jīng)球，并隨著傳代的進(jìn)行，堅(jiān)持增殖才能和向多種神經(jīng)子代細(xì)胞分化的才能。

一、  神經(jīng)干細(xì)胞的分別和傳代

無菌條件下取重生SD大鼠(出世48h內(nèi))腦組織，D-Hanks液充分漂洗后，在解剖顯微鏡下剝離腦膜，準(zhǔn)確分別海馬，用眼科剪將海馬剪碎后，再轉(zhuǎn)移到DMEM/F12(1:1)加B27 和bFGF(20ng/ml)的無血清培養(yǎng)基，吸管吹打機(jī)械分別制造單細(xì)胞懸液，臺盼藍(lán)染色后細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104~5個(gè)/ml，置于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，每孔參加細(xì)胞懸液500μl。待神經(jīng)球構(gòu)成后再次機(jī)械分別克隆制造單細(xì)胞懸液，仍以5×104個(gè)/ml的細(xì)胞濃度置于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，每孔參加細(xì)胞懸液500μl。爾后每7d機(jī)械分別克隆傳代1次，方法同前。
 
二、BrdU符號

將BrdU溶于無血清培養(yǎng)基，過濾除菌后參加神經(jīng)球構(gòu)成后再次機(jī)械分別克隆制造的單細(xì)胞懸液中(BrdU終濃度為5μmol/L)，培養(yǎng)7d待新的神經(jīng)球構(gòu)成后，將神經(jīng)球轉(zhuǎn)移到預(yù)先涂布有多聚賴氨酸的培養(yǎng)板中，貼壁2h行BrdU免疫細(xì)胞化學(xué)染色。
 
三、  神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化

選取部分上述傳代后構(gòu)成的次代神經(jīng)球栽培于預(yù)先涂布有多聚賴氨酸的24孔培養(yǎng)板中，并參加有血清培養(yǎng)基(含10％胎牛血清的DMEM/F12)，一部分神經(jīng)球于貼壁2h后行Nestin免疫細(xì)胞化學(xué)染色，另一部分神經(jīng)球持續(xù)培養(yǎng)，調(diào)查其生長分化情況。另將一部分次代神經(jīng)球機(jī)械分別制成單細(xì)胞懸液后參加有血清培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)，7d后分別行Tuj1 、GFAP 、Galc 免疫細(xì)胞化學(xué)染色。
 
四、  條件培養(yǎng)液的制備

取1g雞胚的后肢骨骼肌組織，參加9mlD-Hanks液中冰浴勻漿15min，離心獲得上清液，過濾除菌后，加兩倍體積DMEM/F12培養(yǎng)基制成條件培養(yǎng)液備用。
 
五、  神經(jīng)干細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化

將一部分次代神經(jīng)球機(jī)械分別制成單細(xì)胞懸液后分別參加條件培養(yǎng)液和有血清培養(yǎng)基(含10％胎牛血清的DMEM/F12)中對照貼壁培養(yǎng)，7d后均行ChAT免疫細(xì)胞化學(xué)染色。